1. 什么是TFA盐？

首先，要明白TFA是怎么来的。

在多肽固相合成（SPPS）中，最常用的方法是Fmoc化学法。

在每一个氨基酸连接后，都需要用哌啶 去除Fmoc保护基，暴露出氨基进行下一个循环。

合成完成后，需要将多肽从固相载体上“切割”下来，并同时去除所有侧链保护基。

这个切割过程通常使用一种强酸性的切割液，其中最常用的配方就含有三氟乙酸（TFA）。

在酸性条件下，多肽链上的一些碱性氨基酸残基（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）以及N-末端氨基会质子化，带上正电荷。

为了维持电中性，这些正电荷会与溶液中的TFA阴离子（CF₃COO⁻）结合，形成多肽-TFA盐。

所以，最终粗品多肽通常是含有大量TFA反离子的混合物。

2. 为什么要去除TFA盐？

尽管TFA在合成中必不可少，但在最终产品中，它却会带来一系列问题：

a. 生物学活性干扰（最主要原因）

TFA的生物学毒性：三氟乙酸根（CF₃COO⁻）本身具有一定的细胞毒性。在细胞实验、动物实验或作为治疗药物使用时，残留的TFA会干扰实验结果，甚至对生物体造成伤害。

非生理性反离子：在生物体内，与带正电的氨基酸残基结合的正常反离子是氯离子（Cl⁻）等。TFA是一个非天然的、强酸性的“异类”，它的存在可能会影响多肽与受体、酶或其他生物大分子的正确相互作用，从而抑制或改变其生物活性。

b. 分析测试的干扰

质谱分析：TFA会严重抑制多肽在质谱中的离子化效率，导致信号强度减弱、信噪比变差，影响分子量确认的准确性。这就是为什么在做质谱前，经常需要先进行脱盐处理。

核磁共振：TFA中的氟原子和质子信号会干扰¹⁹F-NMR和¹H-NMR谱图，影响结构解析。

HPLC分析：TFA本身在低波长紫外下有吸收，并且会改变多肽在反相色谱上的保留时间和峰形。虽然常作为流动相添加剂，但样品中过高的TFA含量会影响定量和定性分析。

c. 物理化学性质的不稳定性

pH值不稳定：TFA盐形式的多肽溶液通常是强酸性的。长期储存时，这种酸性环境可能催化多肽的降解，如天冬酰胺的脱酰胺、肽键的水解等。

吸湿性：TFA盐形式的多肽往往吸湿性更强，更容易吸收空气中的水分，导致称量不准确和产品不稳定。

d. 制剂和应用的限制

对于要用于注射给药的多肽药物，TFA残留是必须严格控制的。药典（如USP、EP）对此有明确的限度要求（通常要求很低，例如<0.1%）。

在制剂过程中，TFA的存在可能影响多肽的溶解性、与辅料的相容性以及最终产品的pH和稳定性。

3. 如何去除TFA盐？

常用的去除TFA盐（即“脱盐”）的方法有：

冷冻干燥后反复溶解-冻干：将多肽溶于少量水中或稀醋酸水溶液，然后冻干。此过程可以带走部分挥发性TFA，但效率不高。

离子交换法：这是最有效和最常用的方法。

将多肽溶液上样到强阴离子交换树脂上。

TFA阴离子（CF₃COO⁻）会与树脂上的官能团（如Cl⁻或OH⁻）发生交换，被牢牢吸附在树脂上。

多肽本身（带正电）则不被保留，随流动相流出。

收集含多肽的流分，冻干后即可得到不含TFA盐的多肽（通常是醋酸盐或盐酸盐形式）。

反相制备色谱：在纯化多肽的同时，也可以有效去除TFA。在制备过程中，TFA被洗脱掉，收集到的多肽主峰经过冻干后，TFA含量会大大降低。

总结

去除多肽合成中的TFA盐，不是一个可有可无的步骤，而是保证多肽产品质量、生物活性和安全性的关键后处理环节。其主要目的是：

消除TFA的细胞毒性，恢复多肽的真实生物活性。

避免对分析测试（如质谱）的干扰。

提高多肽的长期稳定性。

满足药物制剂的严格法规要求。